當(dāng)生物指示劑暴露在滅菌循環(huán)內(nèi)，預(yù)期所有的測試物品都無菌。滅菌過程中所有關(guān)鍵參數(shù)都達(dá)標(biāo)了。生物指示劑被激活和培養(yǎng)。在接下來幾天的培養(yǎng)期中，暴露的生物指示劑結(jié)果被記錄下來。希望除了陽性對照之外，你永遠(yuǎn)不會看到陽性結(jié)果 (黃色)。但如果有一天你把樣本從培養(yǎng)器里拿出來，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的陽性(黃色)指示劑，你該怎么辦呢?

  最近我們收到一位客戶的來信，他在使用自含式生物指示劑時遇到了讓他感到有所顧慮的情況。滅菌循環(huán)是在134°C下7分鐘。暴露的指示劑培養(yǎng)48小時檢測為陰性(紫色)。然而一些暴露的指示劑在隨后的48小時觀察中，檢測呈陽性(黃色)。最后，客戶提到過去他們使用每支含菌量105時，沒有經(jīng)歷過“失敗"。從那以后他們就改用了106，偶爾會看到48小時后呈現(xiàn)陽性結(jié)果的情況 。

  說明書上顯示制造商必須遵守FDA縮短培養(yǎng)時間（RIT）的標(biāo)準(zhǔn)，方能標(biāo)注生物指示劑培養(yǎng)48小時即可出結(jié)果（或少于7天的培養(yǎng)期）。測試必須一式三份使用至少三個單獨(dú)批次，要求100個生物指示劑暴露于部分滅菌循環(huán)，使得100個暴露的指示劑中有30至80個呈陽性。

將暴露的生物指示劑進(jìn)行培養(yǎng)，并在七天內(nèi)定期對陽性指示劑進(jìn)行記錄。如果48小時內(nèi)記錄的陽性指示劑數(shù)量除以7天內(nèi)的陽性指示劑數(shù)量結(jié)果大于0.97，那么生物指示劑培養(yǎng)48小時即可出結(jié)果的說法就是成立的。例如，到了第7天如果總計(jì)觀察到78個陽性指示劑，那么至少需要在48小時內(nèi)記錄76個陽性。76 ÷ 78 =0.974 。如果在48小時內(nèi)檢測到75個或更少數(shù)量的指示劑呈陽性。那就說明產(chǎn)品沒有通過 RIT測試，75÷78=0.962。

  了解了RIT測試的具體情況，可以看出如果培養(yǎng)時間超過標(biāo)簽要求，可能會有更多指示劑呈陽性。然而，RIT測試的目標(biāo)是“量變區(qū)"，有些暴露的指示劑為陰性，有些為陽性。常規(guī)滅菌循環(huán)不針對該區(qū)域開發(fā)。經(jīng)驗(yàn)證和批準(zhǔn)的滅菌循環(huán)旨在實(shí)現(xiàn)致死劑量遠(yuǎn)超孢子滅活的量變區(qū)。有效的滅菌循環(huán)實(shí)現(xiàn)的致死量遠(yuǎn)超量變區(qū)。

  當(dāng)達(dá)到這個量變區(qū)時，每個指示劑活孢子數(shù)量已降至0、1、2或極少有存活的受損孢子。存活孢子數(shù)量為0的指示劑在48小時、7天或以上檢測為陰性。具有一個或多個存活孢子的指示劑通常在48小時或更短時間內(nèi)呈陽性。最后要考慮的是，指示劑如果有一個或兩個受損的孢子可能無法生長，修復(fù)消毒劑造成的損害，生長、繁殖、代謝培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而產(chǎn)生酸性副產(chǎn)物，導(dǎo)致pH指示劑變成黃色。對于這些指示劑而言，測試結(jié)果會呈陰性還是陽性是有疑問的。此外，由于孢子的嚴(yán)重?fù)p傷，生長和繁殖可能會延遲，從而在48小時的時間內(nèi)呈陰性結(jié)果，但超過48小時則最終變成黃色。這種現(xiàn)象只會發(fā)生在量變區(qū)。更長的滅菌時間能成功殺死所有孢子。如上所述，如果沒有孢子存活，指示劑將在七天或更長時間后依然檢測為陰性。

  為了評估有疑問批次的指示劑的抗性，我們對數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧，有證據(jù)表明48小時后可能出現(xiàn)額外的陽性反應(yīng)。在抗力儀(BIER)中處理了總共940個EZTest指示劑，來評估121°、124°、129°、132°、134°和135°C溫度下的D值。在消耗的940個指示劑中，48小時后僅出現(xiàn)6個額外的陽性指示劑。對于在48小時觀察到失活的所有暴露的指示劑而言，在7天的培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)陽性結(jié)果。

  在134°C下進(jìn)行D值評估時，2.0、2.5、3.0和3.5分鐘時實(shí)現(xiàn)了對孢子的殺滅。正如你所見，如果滅菌達(dá)到規(guī)定的致死劑量（對應(yīng)于134°C飽和蒸汽下暴露7.0分鐘的生物指示劑，在任何情況下客戶都不會看到陽性結(jié)果。這個客戶在48小時后發(fā)現(xiàn)了額外的陽性指示劑，這清楚地表明滅菌循環(huán)產(chǎn)生的致死劑量與量變區(qū)效果相當(dāng)。客戶的所有暴露指示劑在48小時的時候均呈陰性，48小時后少數(shù)呈陽性。這表明致死劑量接近量變區(qū)的終點(diǎn)，與我們1.5或2.0分鐘BIER循環(huán)的情況相似。  

問題仍然存在，為什么指示劑在134°C, 7分鐘循環(huán)測試中呈陽性?

 抗性準(zhǔn)確的生物指示劑在此滅菌循環(huán)下可能出現(xiàn)陽性結(jié)果的原因有幾個：

  1.溫度探頭顯示134°C，但存在錯誤，滅菌室內(nèi)的溫度其實(shí)比這低很多

  2.溫度探頭顯示134°C，是準(zhǔn)確的，但不代表放置指示劑的環(huán)境中全部都是這個溫度。負(fù)載內(nèi)的包裝和/或位置可能會阻礙蒸汽滲透到指示劑的位置或指示劑的位置有空氣。

  3.壓力探頭指示的壓力與飽和蒸汽相對應(yīng)條件在134°C(即44.10 psia)，但其實(shí)有誤差，滅菌室內(nèi)實(shí)際上大多數(shù)位置的壓力是不同的。

  4.壓力探頭是準(zhǔn)確的，但由于在負(fù)載內(nèi)的包裝和/或位置的原因，讀數(shù)不能代表放置指示劑的環(huán)境內(nèi)的普遍情況

  從滅菌室(以及EZTest指示劑)中去除空氣和/或通往EZTest指示劑的蒸汽受到了阻礙。在高溫和較短的滅菌循環(huán)下，這是最常見的問題。由于滅菌循環(huán)使用的包裝原因，這個問題會更嚴(yán)重。孢子就會對整體的環(huán)境作出反應(yīng)，綜合的殺滅效力會比任何測量方式都要精確。(溫度和壓力探頭無法區(qū)分飽和蒸汽和干熱。)自含式指示劑EZTest可以很好地檢測到滅菌循環(huán)不足，因?yàn)樗墓δ芫拖褚粋€氣阱。不像STRIP BI的可滲透玻璃紙包裝，EZTest進(jìn)行空氣/蒸汽交換的位置是通過排氣帽進(jìn)行的。由于氣體交換有限，EZTest創(chuàng)造了一個“最壞的環(huán)境"，因此可以比任何其他類型的生物指示劑更好地檢測排氣/蒸汽滲透效率低下的情況。

 另一種可能是暴露和培養(yǎng)的指示劑在培養(yǎng)期內(nèi)被污染了。污染物導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色變化。出現(xiàn)假陽性，其實(shí)孢子已經(jīng)殺滅了。在培養(yǎng)期內(nèi)晃動、跌落或倒置激活的指示劑都可能導(dǎo)致蓋子里的濾紙片變濕，引入污染物的可能性增加。 

  處理后污染是必須考慮的情況。然而,在這個特定的案例中，有一種說法降低了這種情況的可能性。在過去，X10^5的含菌量用戶從未遇到過這種問題。換成X10^6 含菌量的EZTest以后才出現(xiàn)這個問題。這表明正在使用的滅菌循環(huán)已經(jīng)提供了一定致死劑量，能夠使含菌量較低的指示劑不被激活。當(dāng)含菌量增加十倍后，致死劑量更高，只是偶爾有一個孢子存活。

  從本質(zhì)上說，生物指示劑的表現(xiàn)符合它的預(yù)期。這就是生物指示劑的使用目的，所以生產(chǎn)無菌產(chǎn)品的企業(yè)必須使用生物指示劑;它證明了滅菌室里已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了殺滅孢子的條件。結(jié)果是一致的。記住，“無菌"一詞的定義是所有活的微生物都不存在，而不是根據(jù)溫度、壓力和Fo值來確定。如果您發(fā)現(xiàn)自己的指示劑處于探頭所指示能殺滅細(xì)菌的情況，但結(jié)果卻呈陽性，記住不論預(yù)期的殺滅劑量是怎樣的，微生物原本是在滅菌室，現(xiàn)在是在培養(yǎng)器里生長。很明顯，指示劑受到的滅菌效力是不夠的。